«ومَن یَتَوکل علی اللهِ فهُوَ حَسبُه»

-        مقدمه بحث:

گرچه نقش حیاتی مولکول DNAدرانواع مختلف موجودات در دهه ی1950 به خوبی شناخته شده بود امّا مطالعه DNA درآن زمان بسیار مشکل بودواطلاعاتی که درباره ی DNAبه دست می آمد بیشتر از طریق تفسیر آزمایش های کلاسیک ژنتیکی بود.

انگیزه اولیه برای دستکاری ژنی درمحیط غیر زنده Invitroبه اوائل دهه 1970 میلادی برمی گردد که همراه با پیدایش فنونی جهت برش وچسباندن مولکول DNA وانتقال آن به کلی باسیل بود. در سال 1967آنزیم DNAلیگاز کشف شد. این آنزیم مانند یک چسب مولکولی دو قطعه  DNAرابه هم می چسباند.کشف آنزیم برشگر محدود کننده در سال 1970 میلادی مرحله مهمی در تحول ژنتیک بود.

ترکیب مولکولی که شامل DNAبیگانه وارد شده به ناقل باشد را کایمرا(Chimeras) می نامند ساختن چنین ترکیبی را مهندسی ژنتیک نامیده اند.

-        همسانه سازی یا کلونینگ به مجموعه مراحلی گفته می شود که ارگانیسم هایی شبیه به هم را ازیک والد به دست می آورند .همسانه سازی به 3صورت است:

1-      شبیه سازی یک موجود کامل مثل دالی

2-     همسانه سازی بافت که از یک سلول اولیه در آزمایشگاه بافت مصنوعی تولید می شود.

3-     همسانه سازی ژن که شامل انتقال ژن از یک ارگانیسم دهنده به ارگانیسم گیرنده(با کتری)

در مهندسی ژنتیک عموماً منظور کلونینگ همسانه سازی ژن است وشامل مراحل زیر است:

I.                     خالص سازی ژن DNA  از ژنوم دهنده: الف) شکستن سلول ها                    ب)جداسازی DNA ازبقیه ترکیبات

الف) شکستن سلول ها   1-روش های فیزیکی که توسط نیروهای مکانیکی صورت می گیرد.

              2روش شیمیایی _    در سلول های دارای غشاء( حیوانی) توسط دتر جنت(SDS ) غشاء تخریب وترکیبات سلولی آزاد  می شود.

                 _    در  سلول های دارای دیواره به تیماربیشتری نیاز دارد( سلول کلی باسیل)        

در Ecoli دیواره توسط آنزیم لیزوزیم وماده شیمیایی EDTAتیمار می شود ولیزوزیم ترکیبات پلی ساکاریدی دیواره  را می شکند.

EDTA(اتیلن دی آمین تتراستات) با جذب یون منیزیم باعث شست شدن دیواره وتخریب آن می شود.سپس برای تجزیه غشاء نیز از

دترجنت( SDS) استفاده می شود.

ب)بعد از تخریب حالا دو روش برای جداسازیDNA  از بقیه ترکیبات سلولی استفاده می شود:

روش اول: تخریب همه ترکیبات سلولی به جزDNA (برای سلول هایی که مقدارچربی وکربوهیدرات کم دارند)

-        برای جدا کردن پروتئین ها از عصاره ی سلولی از فنل یا مخلوط فنل با کلروفرم به نسبت مساوی استفاده می شود.که پروتئین ها را رسوب داده ونوکلئیک اسیدها را درمحلول آبی باقی می گذارند.پس از سانتریفوژ مخلوط ، محلول آبی حاوی نوکلئیک اسیدها با پیپت قابل جدا سازی است وبرای جدا سازی RNA نیز در پایان از آنزیم ریبونوکلئاز استفاده می کنیم وDNAخالص به دست می آید.

 

روش دوم: جدا سازی DNAاز ترکیبات سلولی به طور انتخابی که به دوطریق قابل انجام است:

1-      استفاده از دتر جنت CTAB (ستیل تری متیل آمونیوم برومید ) که با اسیدهای نوکلئیک ترکیب نامحلول ایجاد وسایر ترکیبات در مایع رویی باقی می ماند.رسوب رابا سانتریفوژ جمع کرده ودر محلولNacl   1مولار حل می کنیم تا پیوند اسید نوکلئیک ها با CTAB  شکسته شود وسپس RNAتوسط ریبونوکلئاز حذف می شود.

2-     کروماتوگرافی تعویض یونی توسط حلال رزین: ( براساس اختلاف در بار الکتریکی)

-        نوکلئیک اسیدها بار منفی ورزین بار مثبت دارد پس DNA و RNA به رزین متصل می شوند.

-        پیوندهای الکتریکی با نمک ازبین می روند. پیوندهای محکم تر نیاز به غلظت نمک بیشتری دارند. عصاره سلولی از ستون عبور کرده وستون حاوی رزین بوده ومواد منفی را جذب می کند با عبور محلول نمکی به ترتیب پروتئین!  ! RNA DNA(با نمک غلیظ تر) جدامی شوند.

II.                   برش ژن خالص شده وناقل همسانه سازی (وکتور):

علت نیاز به وکتور چیست؟ ژن مورد نظربرای پایدار ماندن نیاز به مبدأ همانند سازی دارد به همین خاطر باید ژن را به یک رپلیکان که دارای مبدأ همانند سازی است متصل کرد این رپلیکان ها همان وکتورها می باشند در عدم حضور رپلیکان( وکتور) ژن وارد شده به سلول در طول تکثیر سلول میزبان حذف می شود.

                                                       پلازمید  F که حاوی ژن tra ( باروری) است ودر انتقال الحاقی نقش دارد.

                              پلاسمیدها      پلازمید    R ژن مقاوم به آنتی بیوتیک را حمل می کند.  

انواع وکتورها                                 پلازمید Ti بیماری زای باکتری های اگزوباکتریوم تومه فاشیسن که تولید گال تاجی می کند.

                                                          ناقل ویروسی باکتری ها(باکتریوفاژها)       ناقل های مشتق از فاز M13

                              ناقل ویروسی                                                                         فاژ لامبدأ

                                                                                                                   وکتورسلول جانوری به نام SV40

                                                          ناقل های ویروسی یوکاریوتی

                                                                                                              وکتور آدنوویروس ها ! قادرند قطعات بزرگDNAراحمل کند.

                                کاسمیدها: هیبر یدی از فاژ     و پلاسمید که مثل پلازمید همانندسازی ومثل فاژ     بسته بندی می شود.

                                فاژمیدها: هیبریدی از فاژهای تک رشته ای وپلازمید ودو مبدأ همانندسازی دارد.

                                 کروموزوم مصنوعی(Artificial chromosome)                        نوع باکتریایی یا BAC

                                                                                                                نوع مشتق شده از فاژP1

                                                                                                               نوع مخمرها YAC

                                                                                                             نوع انسان HAC

-        کاربرش ژن وناقل توسط آندونوکلئاز های محدود گر انجام می شود. اکثر این آنزیم ها با برش DNA دو انتهای چسبنده با توالی پالیندرومی ایجاد می کنند.(از انتهای 5َ یا 3 َ دو رشته شبیه هم اند)

 

                                                                        چسبنده             چسبنده             چسبنده           تراز

چند نوع از آنزیم های محدود گر عبارتند از :   …,  PvuII  -  PVuI   -   Bg/II  -   ECOR1

                                                                                                                                                 (کلی باسیل)     (باسیلوس گلوبی جی)        (پروتئوس ولگاریس)

چرا آنزیم های محدود گرDNA باکتری رابرش نمی دهند؟

III.                 اتصال ژن به ناقل! تولید مولکول DNA نوترکیب(کایمرا) توسط DNA لیگاز این مولکول DNAدارای مبدأ همانند سازی است ودر سلول پایدار باقی می ماند.

IV.                انتقال DNA نوترکیب به میزبان( E.Coli) یا ترانسفورماسیون باکتری:

تلاش های اولیه برای وارد کردن DNA به باکتری ناموفق بود تا اینکه در سال 1970 مَندل وهیگا دریافتند که اثر دادن کلرید کلسیم برباکتری باعث ورود DNA فاژ وسپس 1972 کوهن نشان داد که این ماده برای ورود DNA پلاسمیدی نیز مؤثر است .( تیمار با کلرید کلسیم)

-         سلول هایی که قادر به دریافت DNA باشند سلول های مستعد (Competent cells) گویند.برای انتقال DNA به سلول ها 6 روش وجود دارد:

1- روش شیمیایی: با تأثیر کلسیم کلرید برای باکتریها بر دیواره ی سلولی موجب اتصال DNAبه سطح سلول شده وشوک حرارتی نیز به دنبال آن باعث ورود DNA به سلول می شود( E.Coli)

2- شوک الکتریکی یا الکتروپوریشن: برای انواع سلولهام مؤثر است . ( از جمله باکتری ها )

سلول برای مدت کوتاه ( چندهزارم ثانیه ) در میدان الکتریکی قوی قرار گرفته که باعث می شود منافذ سلولی باز یا کانال های غشایی فعال شده و DNA  وارد سلول می شود . بازدهی این روش از روش شیمیایی بالاتر است .

3  لیپوفکشن : از لیپوزوم ها برای انتقال DNA به سلول های مختلف استفاده می شود . پس از قرار دادن DNA در لیپوزوم این ساختار به غشاء الحاق شده  یا به صورت آندوسیتوز  وارد سلول می شود .

4  ریز تزریقی : روش فیزیکی انتقال مستقیم DNA به هسته ی سلول های گیاهی یا حیوانی توسط سرنگ نازک است . سلول ها توسط لوله ای مکنده ثابت نگه داشته و DNA توسط سرنگ نازک به هسته منتقل می شود . ( در تولید حیوان تراریخته )

5 تفنگ ژنی : ( روش بیولیستیک Biolistic )

DNA توسط ذرات طلا یا تنگستن پوشیده شده در انتهای گلوله های پلاستیکی قرار می گیرد و توسط یک تفنگ ژنی به سلول ها شلیک می شود . قطر ذرات پرتابی حدود mµ4 بوده که با سرعت بالا سلول را بمباران می کند ( سلول حیوانی و خصوصاً گیاهی )

6 ترانسداکشن : استفاده از ویروس ها

ناقلین ویروسی با آلوده کردن سلول باعث انتقال DNA به طیف وسیعی از سلول ها می شوند . ( باکتری حیوانی گیاهی ) برای انتقال DNAبه سلول های یوکاریوتی عموماً ترانسفکشن نامیده می شود .

V.                   شناسایی سلول های حاوی DNA نو ترکیب ( غربال کردن ) :

پس از انتقال DNA نو ترکیب به باکتری و همانند سازی متعدد این مولکول ( کلون شدن یا همسانه سازی )سه دسته سلول در محیط به دست می آید :           اول : سلول هایی که بدون تغییر مانده اند و DNA دریافت نکرده اند .

                                                                  دوم : سلول هایی که ناقل فاقد ژن ( غیر نو ترکیب ) را دریافت کرده اند .

                                                                 سوم : سلول هایی که DNA نو ترکیب را دریافت کرده اند .

برای جداسازی سلول های دارای DNA نو ترکیب ( ترانسفورم شده ) از سایرین به روش زیر عمل می کنیم :

ناقلین دارای یک ژن مقاوم به آنتی بیوتیک هستند پس در محیط کشت انتخابی حاوی آنتی بیوتیک فقط سلولهایی رشد می کنند که دارای ناقل هستند ودسته ی اول سلولها حذف می شوند.

برای شناسایی سلول نوترکیب از سلول های غیر نوترکیب از روش غیر فعال  شدن الحاقی استفاده می شود. وکتورها علاوه بر ژن مقاومت به آنتی بیوتیک  دارای یک ژن نشانگر انتخابی marker  Selectable نیز هستند . محصول این ژن به سلول میزبان ویژگی خاصی مثل رنگی شدن کلونی باکتری ها می دهد . با توجه به این که محل ورود DNA به ناقل درون این ژن می باشد پس ژن غیر فعال شده و در سلول های نو ترکیب رنگی تولید نمی شود و تفکیک انجام می شود و یا مقاومت به آنتی بیوتیک در سلول میزبان ایجاد می کند .

VI.                 استخراج ژن:  پس از تأثیر دوباره آنزیم محدودگر اولیه بر DNA نو ترکیب و ایجاد مخلوطی از قطعات DNA ناقل و ژن کلون شده توسط الکتروفورز در ژل انجام می شود . ژل در میدان الکتریکی مانند یک غربال مولکولی عمل می کند .

معمولاً از آگارز و پلی آکریل آمید به عنوان ژل در سیستم الکتروفورز استفاده می شود . ژل پلی آکریل آمید منافذ کوچک تری نسبت به آگارز دارد و برای جداسازی پروتئین ها و مولکول های DNA کوچک به طول 10  تا 1000  نوکلئوتید مورد استفاده قرار می گیرد و از ژل آگارز برای قطعات بزرگ تر DNA به طول 500  تا 20000  نوکلئوتید استفاده می شود .

برای مشاهده مولکول های DNA پس از الکتروفورز ، ژل را با اتیدیوم بروماید رنگ آمیزی کرده و در معرض پرتوی U.V قرار می دهند . ماده ی رنگ آمیزی پس از ورود به DNA از خود پرتو فلورسانس قرمز متمایل به نارنجی ساطع می کند .  

 

 

 تهیه وتنظیم :  سید علیرضا سجادی    سرگروه زیست شناسی

 

 

 

 

 

 

 

 

منابع:

1-  آنالیز ژن وژنوم           ریچارد جی .ریس            ترجمه: دکتر مهرداد هاشمی و...                     

2- ژنتیک از کلاسیک تا ژنومیک           تالیف : حسن اکرمی                

3- بیولوژی کمپل             ترجمه : گروه مترجمین نشر خانه زیست شناسی            

4-  مبانی ژنتیک                 تالیف: دکتر یوسف سیدنا             

   

+ نوشته شده توسط سرکار خانم حسنيان وآقای سجادی در دوشنبه بیست و نهم فروردین 1390 و ساعت 10:18 |